| グリア生物学 |
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| O4-1
活性化アストロサイトにおけるP2X7受容体の機能的発現変動について
古田 能裕，須藤 嵩史，向井 あゆみ，山本 美菜，西田 健太朗，長澤 一樹
京都薬大・衛生化学
Astrocytes are the most abundant cells in the CNS, and play roles in maintenance of brain homeostasis. Under pathological conditions, astrocytes are reported to be activated and to exhibit altered functional expression of neuro-/glio-transmitter clearance system such as glutamate transporters, together with their change from a polygonal to process-bearing morphology. Previously, we demonstrated that P2X7 receptors（P2X7Rs）expressed by cultured astrocytes were constitutively activated under unstimulated basal conditions and had a role in regulation of their engulfing activity. Here, we examined whether functional expression of P2X7Rs was altered in activated astrocytes. In this study, to activated astrocytes, we treated them with 0.15 mM db-cAMP for 3 days or 0.4 mM H2O2 for a day, and their morphology and GFAP expression profile clearly indicated their activation without decrease in their viability. In the both of activated astrocytes, P2X7R-dependent uptakes of YO-PRO-1 and latex beads, an indicator for channel/pore and engulfing activity, respectively, were significantly decreased comparing to the case in normal astrocytes. At mRNA levels, the expression of full-length P2X7R, but not its C-terminal-truncated splice variants, was decreased by H2O2-, but not db-cAMP-, treatment. In immunocytochemical analysis, P2X7R immunoreactivity, which was mainly detected at the plasma membrane in normal astrocytes, was detected in the cytosol in the both activated astrocytes. Together, it is indicated that under activated conditions, astrocytes exhibit altered functional expression of P2X7Rs, but their underlying mechanisms might be differ in the presence or absence of oxidative stress. |
| O4-2
アストログリア細胞においてbFGF投与で増加したマイクロRNAの機能的役割
沼川 忠広，中島 進吾，山本 宣子，大島 淑子，小高 陽樹，橋戸 和夫，安達 直樹，功刀 浩
国立精神・神経医療研究センター 神経研究所 疾病研究第三部
Regulation of neuronal gene expression by microRNAs（miR）is an important concern, and recent studies have suggested that altered levels of brain specific miRs are beneficial biomarkers for brain-related diseases. Previously, we reported that brain-derived neurotrophic factor increased expression of miR132 for maintaining synapses（Numakawa et al, Neurochem Int. 2011）. However, glial roles of miRs have been poorly understood compared with their neuronal roles. Here we show the miR134 induction by another growth factor such as basic fibroblast growth factor（bFGF）in pure astrocyte. Using cultured astroglia prepared from the cerebral cortex of rats, we confirmed dose-dependent upregulation of miR-134 by bFGF application. Next, we determined miR134 function in glial cells. When performing overexpression of miR134 in glial cultures, increased levels of both GFAP and S100beta（are astroglia makers）were observed. It is well known that bFGF promotes astroglial maturation. Therefore, it is possible that bFGF-mediated miR134 is involved in the glial maturation. This was supported by the Grant-in-Aid for Scientific Research（B）（JSPS KAKENHI 24300139）and by Challenging Exploratory Research（JSPS KAKENHI 25640019）（T. N.）. |
| O4-3
ミクログリアはP2Y1受容体制御により神経保護的アストロサイトを誘導する
篠崎 陽一1,4，田中 謙二2，池中 一裕3，小泉 修一1,4
山梨大学大学院医学工学総合研究部薬理学講座1，慶應義塾大学医学部精神・神経科学教室2，自然科学研究機構生理学研究所・分子神経生理部門3，独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業4
各種脳疾患時にミクログリア及びアストロサイトが活性化するが、活性化の時・空間的な様相は両者で全く異なる。ミクログリアは、疾患初期に中心病巣から活性化するのに対し、アストロサイトの活性化は遅発性で周辺領域に起きる。しかし、これら時・空間的に異なるグリア細胞活性化の分子メカニズム、さらにその病態生理学的意義の多くは不明である。今回我々は、ミクログリアによるアストロサイト活性化誘導とそのメカニズム、さらにこの活性化アストロサイトによる神経保護作用について報告する。実験には物理的脳損傷（TBI）マウスモデルを用いた。In vivo TBIモデルで大脳皮質に傷害を与えると、時・空間的に異なるグリア細胞の活性化、つまり、1日後に傷害コア部位を中心にミクログリアの活性化が、3日後に傷害コア領域の周辺部位でグリア瘢痕様のアストロサイトの活性化が観察された。活性化アストロサイトは傷害領域を包囲し、同部位の神経細胞死を抑制していた。アストロサイト機能変化は、ミクログリア活性化抑制薬ミノサイクリンにより抑制されたことから、ミクログリア依存的であることが示唆された。このような活性化アストロサイトの誘導は、ミクログリア由来の炎症性サイトカイン（TNFα、IL-6、IL-1β）依存的であった。また、これらサイトカインはアストロサイトP2Y1受容体発現を抑制しており、P2Y1受容体欠損マウスではアストロサイトの神経保護作用の増強が観察された。アストロサイト特異的P2Y1受容体欠損及び同過剰発現マウスで、本フェノタイプ変化がそれぞれ再現及び抑制されたことから、アストロサイトP2Y1受容体制御が神経保護的アストロサイト誘導のトリガーであることが示唆された。以上、TBIにより早期活性化したミクログリアは、アストロサイトのP2Y1受容体シグナルを制御することにより、時・空間的に異なる活性化を誘導することにより、アストロサイトを神経保護的フェノタイプに変化させていることが示唆された。 |
| O4-4
脳梗塞後のミクログリア機能と行動に対するSema4D作用の解析
澤野 俊憲1，渡邉 文也1，土江 伸誉2，古山 達雄3，稲垣 忍1
大阪大学大学院医学系研究科保健学専攻神経生物学研究室1，兵庫医療大学共通教育センター2，香川県立保健医療大学3
脳梗塞は虚血に続き、炎症によって二次的な傷害がもたらされる免疫学的なイベントである。このような環境下においては、脳内固有の免疫細胞であるミクログリアが重要な役割を果たしており、脳梗塞を始めとする様々な中枢神経疾患において、その傷害過程と修復過程の双方に関与することが明らかとなっている。ミクログリアはSema4Dをリガンドとするレセプター、Plexin B1とCD72を発現する。Sema4Dは分泌型・膜貫通型の糖タンパクであり、脳内ではオリゴデンドロサイトにおいて発現する。もともとは反発性軸索ガイダンス因子として同定されたSema4Dだが、末梢組織においては"immune semaphorin"としてT細胞に発現し、それを受容したB細胞の活性化を制御し、免疫機能に影響する。よって、Sema4Dがミクログリアに対して何らかの影響を与えることが予測されるが、脳梗塞時におけるミクログリアへの作用は未だ不明である。そこで、本研究では脳梗塞後の傷害/修復過程におけるSema4Dの役割を明らかにすることを目的として、野生型マウスとSema4D欠失型マウスそれぞれに中大脳動脈閉塞術を実施し、両群から得られるミクログリア機能の差を検出した。その結果、野生型マウスでは傷害作用を示すM1ミクログリアが、Sema4D欠失型マウスでは保護的な作用を示すM2ミクログリアが優位となることが明らかとなった。さらに、Sema4D欠失型マウスでは脳梗塞巣周辺における死細胞数の減少を認めた。これらのSema4D欠失による細胞レベルの変化が、行動レベルにどのように影響するのかを検証するため、痛み刺激に対する逃避反応を観察した。その結果、Sema4D欠失型マウスでは野生型マウスに比べ、脳梗塞による痛み刺激に対する鈍麻が軽度であることが確認された。これらはSema4Dがミクログリア機能に対する影響を介し、脳梗塞後の病態形成・回復過程の双方に関与することを示唆している。 |
| O4-5
小胞体ストレスセンサーBBF2H7のC末端断片はグリオーマ細胞の増殖を促進する
高井 知子，日野 健太，松久 幸司，岩本 秀雄，今泉 和則
広島大学大学院 医歯薬保健学研究院 分子細胞情報学
当研究室で同定したBBF2H7/CREB3L2は小胞体ストレスセンサーとして機能する。BBF2H7は小胞体ストレスに応答して切断され、切断されたN末端断片は転写因子として機能する。一方、C末端断片は細胞外に分泌され、Hedgehog（Hh）-Patched1（Ptch1）経路に作用し、胎生期マウス由来の軟骨細胞の増殖を促進する。本研究では、様々なヒト癌由来細胞で認められるHhシグナルの活性化と癌細胞の増殖に対するBBF2H7 C末端断片の関与を検証した。各種ヒト癌由来細胞における遺伝子発現解析の結果、悪性度が高くHhシグナルの活性化が報告されているヒトグリオブラストーマ由来のU251MG細胞においてBBF2H7の発現レベルが高かった。また、ヒトグリオブラストーマ標本をヒトBBF2H7のC末端断片を認識する抗体を用いて免疫染色を行うと、癌細胞で強いシグナルが確認できた。BBF2H7の高発現が認められたU251MG細胞の培養上清を用いた免疫沈降実験では、切断後のBBF2H7 C末端断片が検出され、C末端断片が癌細胞から分泌されていることが示唆された。さらに、siRNAによってBBF2H7の発現を抑制したU251MG細胞では、Hhシグナルが抑制され、増殖スピードも低下した。BBF2H7発現抑制U251MG細胞に対し、ヒトBBF2H7 C末端断片を含む培養上清を添加すると、Hhシグナルが活性化し、細胞増殖の速度も回復した。以上の結果から、ヒトBBF2H7 C末端断片が癌細胞のHhシグナルを活性化し、細胞増殖を促すことが明らかになった。本研究成果は、小胞体ストレスセンサーBBF2H7を分子標的とした悪性腫瘍に対する新しい治療法の可能性を示唆するものである。 |
| O4-6
バーグマングリアの傍シナプス領域にグルタミン酸輸送体を集積させてグルタミン酸除去を効率化する分子機構
木下 専1，山崎 真弥2，今野 幸太郎3，中山 寿子4，阿部 学2，橋本 謙二5，西岡 朋生6，貝淵 弘三6，宮川 剛7，橋本 浩一4，渡辺 雅彦3，崎村 建司2，上田（石原） 奈津実1
名古屋大院・理・生命理学1，新潟大・脳研・細胞生物2，北大・医・解剖3，広大・医歯薬・神経生理4，千葉大・社会精神保健教育研究センター5，名大・医・神経情報薬理6，藤田保健衛生大学 総合医科学研究所7
CDC42EP1-5/BORG1-5, a family of small GTPase effector proteins, interact with GTP-bound CDC42 or the septin heterooligomers in a mutually exclusive manner, but their physiological roles are unknown. We find that CDC42EP4 in the mouse cerebellar cortex is expressed exclusively in Bergmann glia, in which CDC42EP4 localizes to specific microdomains facing dendritic spines of Purkinje cells. Biochemical analysis of cerebellar lysate indicates that CDC42EP4 is in complex with septins（SEPT2/3/4/5/6/7/8/10/11）and the glutamate transporter GLAST, but not with CDC42. In Cdc42ep4-/- Bergmann glia, GLAST is physically dissociated from septins and delocalized away from the parallel fiber-Purkinje cell synapses. Patch-clamp analysis reveals that treatment of Cdc42ep4-/- cerebellar slices with a glutamate transporter inhibitor aberrantly augments inward current in Purkinje cells, suggesting insufficient glutamate-buffering capacity in Cdc42ep4-/- Bergmann glia. Concordantly, a systematic battery of behavioral tests pinpoints uncompensated motor learning defects in the balance beam test. Together, we conclude that CDC42EP4-dependent interaction with septins is required for the parasynaptic localization and efficiency of GLAST to achieve optimal buffering and clearance of extrasynaptic glutamate and cerebellum-dependent motor learning. | |
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