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幹細胞・細胞分化
O11-1
16番染色体関連miR-484はPCDH19を介して神経幹細胞の運命決定機構を制御する
藤谷 昌司1,2，山下 俊英1
大阪大学大学院医学系研究科分子神経科学1，連合小児発達学研究科こどものこころの分子統御機構研究センター2

　注意欠陥多動性障害（ADHD）は最も一般的な小児の発達障害の一つである。双子研究によりADHDはその原因に遺伝的要素が高いことが知られており、また、最近では、双子の兄弟に自閉症の発症頻度が有意に高いなど、ノルアドレナリン、ドーパミン系の異常単独では説明しきれない不均一な疾患集団を形成する。この不均一な疾患集団は疾患発症への寄与率は比較的高いが、その遺伝子異常を持つ頻度は低いrare variantを持つ複数の集団により形成されているのではないかと考えられる。以前より、16番染色体13.11領域のコピー数の変異（重複、欠失）は、精神発達遅滞、自閉症、てんかん、統合失調症の危険因子として多数の報告がある。また、最近の研究により、一部のADHD患者においてこのrare variantが重複しているという報告がなされた。そこで、我々は、この領域に未知の脳発生に深く関与する遺伝子が複数含まれていると仮定して、9つの遺伝子の中から、新規の遺伝子3つの機能を明らかにした。その中で、今回は、miR-484による神経幹細胞制御機構について報告する。in vitroおよび、in utero electroporation法を用いたin vivo機能解析実験を行った。miR-484の過剰発現により神経前駆細胞の分化が促進され、増殖が低下することが確認された。さらに、miR-484の阻害配列により、分化は抑制されることがわかった。また、luciferase assayを利用したスクリーニングにより、non-cluster型のprotocadherin-19（Pcdh19）がそのターゲットであることがわかった。Pcdh19の機能解析実験及び、レスキュー実験によりPcdh19が、機能的な下流因子であることが同定された。Pcdh19遺伝子の異常は、精神発達遅滞を引き起こすてんかんを発症する。このことにより、本研究によるmiR-484/Pcdh19シグナルによる神経幹細胞の運命決定制御の解明は、発達障害の病態解明につながるコンセプトになるかもしれない。		 O11-2
膜輸送体OCTN1の生体内基質エルゴチオネインによる神経分化促進の細胞内メカニズム
石本 尚大，中道 範隆，森田 明希，増尾 友佑，加藤 将夫
金沢大学大学院医薬保健学総合研究科創薬科学専攻

Ergothioneine（ERGO）is a food-derived hydrophilic antioxidant which is distributed to the brain and taken up into neural stem cells（NSCs）almost solely via solute carrier OCTN1/SLC22A4. Exposure of NSCs to ERGO promotes neuronal differentiation by modulating the expression of basic helix-loop-helix transcription factors via unidentified mechanisms different from antioxidant action（Ishimoto et al., PLOS ONE 9, e89434, 2014）. Elucidation of detailed mechanisms underlying promotion of neuronal differentiation by ERGO may lead to find a novel target for promotion of neurogenesis with an aim to treat neurodegenerative disorders. The aim of the present study was to clarify the mechanisms using primary cultured NSCs derived from wild-type（wt-NSCs）and octn1-deficient（octn1-/--NSCs）mice. Uptake of[3H]ERGO into wt-NSCs increased in a time-dependent manner, whereas octn1-/--NSCs minimally incorporated[3H]ERGO. Exposure of wt-NSCs to ERGO significantly increased the number of cells immunoreactive for the neuronal marker βIII-tubulin, but decreased the number immunoreactive for the astroglial marker glial fibrillary acidic protein, whereas ERGO did not affect such cellular differentiation markers in octn1-/--NSCs, indicating that ERGO promotes neuronal differentiation via OCTN1-mediated transport, but not action on membrane receptors. ERGO remarkably increased protein expression of phosphorylated CREB, which promotes secretion of several neurotrophic factors related to neuronal differentiation. These results suggest that ERGO is taken up into NSCs by OCTN1, and may promote neuronal differentiation at least partially via CREB signaling pathway. Further studies are currently performed to clarify whether ERGO induces neurotrophic factors as downstream signal of CREB.
O11-3
マウス人工多能性幹細胞の増殖および神経前駆細胞への分化に対するムスカリン型アセチルコリン受容体の関与
石塚 俊晶，小澤 亜也子，新田 宗光，渡辺 康裕
防衛医大薬理学講座

[Introduction]Previous studies reported that muscarinic acetylcholine（mAch）receptor may be involved in proliferation and differntiation of neural progenitor cells（NPCs）. As induced pluripotent stem（iPS）cells display properties of self-renewal and pluripotency, they may be a valuable source of NPCs. The present study examined whether stimulation with mAch receptors affects proliferation or differentiation into NPCs of mouse iPS cells.[Materials and Methods]Mouse iPS cells were cultured under feeder-free conditions in the presence of leukemia inhibitory factor（LIF）. The cells were treated by carbachol（a mAch receptor agonist；0.1～10 μM）for 48 h. Proliferation of mouse iPS cells was examined by MTT assay. Mouse iPS cell differentiation was initiated by embryoid body（EB）formation under LIF-free condition. The EBs were pretreated by atropine（a mAch receptor antagonist；0.1～10 μM）and stimulated with all trans retinoic acid（ATRA；1 μM）and/or carbachol（0.1～10 μM）for 4 days and then transferred to fibronectin-coated dishes. The differentiation potential into NPCs was evaluated by Nestin expression using immunofluorescence staining and western blot analysis.[Results]Treatment with carbachol did not affect the proliferation of mouse iPS cells. On the other hand, treatment with carbachol（10 μM）significantly inhibited ATRA-induced Nestin expression in the differentiated cells. Pretreatment with atropine（10 μM）significantly blocked the inhibitory effect of carbachol.[Conclusion]These results suggest that the stimulation with mAch receptor inhibits the differentiation of mouse iPS cells into NPCs.		 O11-4
緑茶成分テアニンによるグルタミン輸送担体Slc38a1機能制御
池野 信介，中里 亮太，檜井 栄一，宝田 剛志，米田 幸雄
金沢大院・薬・薬物学

【目的】グルタミン輸送担体Slc38a1は、神経細胞に高発現してGABAやグルタミン酸生合成の基質を供給する膜輸送担体である。我々は既に、構造類似アミノ酸である緑茶成分テアニンが、強力なグルタミン輸送阻害効果を発揮する事実を報告した。本研究では、神経前駆細胞モデル細胞株であるP19細胞に、Slc38a1の安定発現株を作製して、同細胞の増殖能と神経細胞分化能を解析するとともに、テアニンの薬理学的効果について追究した。【方法】Slc38a1発現ベクターをリポフェクション法でP19細胞に導入後、G418に抵抗性を示す細胞株を選別した。ATRA存在下に浮遊条件下で細胞を4日間培養後、分散した細胞を接着条件下でさらに6日間培養した。また、細胞塊面積とMTT還元能の測定、およびMAP2抗体を用いた免疫細胞染色法とウエスタンブロッティング法を実施した。【結果】P19細胞を浮遊条件下で培養すると大きな細胞塊が形成されたが、Slc38a1安定発現細胞では対照群細胞の場合と比べて、この細胞塊面積の著明な増大と、MTT還元能の有意な上昇が認められた。細胞を分散後、接着条件下で培養すると、MAP2陽性細胞が多数出現したが、Slc38a1安定発現株の場合にはMAP2陽性細胞数の有意な上昇とともに、MAP2タンパク質レベルの有意な上昇が観察された。一方、対照群細胞をテアニン存在下に培養すると、細胞塊面積増大、MTT還元能上昇およびMAP2発現増加がいずれも確認されたが、Slc38a1安定発現細胞を同様の条件下で培養しても、テアニンによるさらなる促進は観察されなかった。テアニン存在下に培養したP19細胞を用いて、Slc38a1遺伝子の上流2959bpまでのプロモーターを用いたレポーターアッセイを行うと、テアニン添加による有意な活性上昇が確認されたが、上流768bpプロモーターを用いた場合には、テアニンによるルシフェラーゼ活性上昇は見出せなかった。【考察】テアニンはSlc38a1発現上昇を介して、神経幹細胞の増殖能と神経分化能をともに正に制御する可能性が示唆される。
O11-5
リチウムによる歯状回神経障害モデルマウスの神経再生の促進
米山 雅紀，芝 達雄，荻田 喜代一
摂南大学薬学部薬理学研究室

Lithium, a mood stabilizer, is known to ameliorate the stress-induced decrease in hippocampal neurogenesis seen in animal models of stress-related disorders. However, it is unclear whether lithium has beneficial effect on neuronal repair following neuronal damage in neuronal degenerative diseases. Here, we evaluated the effect of in vivo treatment with lithium on the hippocampal neuronal repair in a mouse model of trimethyltin（TMT）-induced neuronal loss/self-repair in the hippocampal dentate gyrus（such mice referred to as"impaired animals"）[Ogita et al. （2005）J Neurosci Res 82：609-621]. The impaired animals had a dramatically increased number of 5-bromo-2'-deoxyuridine（BrdU）-incorporating cells in their dentate gyrus at the initial time window（days 3 to 5 post-TMT treatment）of the self-repair stage. A single treatment with lithium produced no significant change in the number of BrdU-incorporating cells in the dentate granule cell layer and subgranular zone on day 3 post-TMT treatment. On day 5 post-TMT treatment, however, BrdU-incorporating cells were significantly increased in number by lithium treatment for 3 days. Most interestingly, chronic treatment（15 days）with lithium increased the number of BrdU-incorporating cells positive for NeuN or doublecortin in the dentate granule cell layer of the impaired animals, but not in that of naïve animals. Taken together, our data suggest that lithium had a beneficial effect on neuronal repair following neuronal loss in the dentate gyrus through promoted proliferation and survival/neuronal differentiation of neural stem/progenitor cells in the subgranular zone.		 O11-6
神経堤細胞を蛍光ラベルしたヒルシュスプルング病モデルの解析
芝田 晋介1，藤村 匠1,2，黒田 達夫2，岡野 栄之1
慶應大・医・生理1，慶應大・医・小児外科2

The absence of the enteric ganglion cell originated from neural crest is the main pathological feature of the Hirschsprung's disease. The genetically modified or drug-induced Hirschsprung's disease mouse model is well established. The ganglion cells of this model are ablated selectively, that mimics Hirschsprung's disease. The purpose of this study is to reveal the characteristics of the abnormal ganglion cells in the alimentary tract from the mouse model in detail. In order to visualize the ganglion cells in vivo, the transgenic mouse strain was used to label the neural crest derivatives with Green Fluorescence Protein（GFP）. The labeled enteric ganglion cells in the myenteric plexus are evaluated immunohistochemically. The deletion of the ganglionic cells was confirmed with the disappearance of the markers including GFP and neuronal markers. The control and aganglionic segment of the alimentary tract was analyzed with the specific markers for various types of intestinal cell types along with the GFP. The detailed analysis of the Hirschsprung's disease model revealed not only the usefulness for the future study but also the discrepancy from the original disease onset.