| 幹細胞・細胞分化 |
|---|
| P2-15
幹細胞由来ニューロンと株化シュワン細胞の共培養によるミエリン形成
渡部 和彦1，石井 智裕1,4，柳澤 比呂子1，三五 一憲1，秋山 けい子1，河上 江美子1，遠藤 堅太郎2，塚本 雅美1，新見 直子1，阿久津 英憲3，三澤 日出巳4
東京都医学総合研究所神経変性病理1，東京都医学総合研究所基盤技術研究センター2，国立成育医療研究センター研究所生殖・細胞医療研究部3，慶應義塾大学薬学部薬理学4
We have previously established in vitro myelinating coculture systems using rat dorsal root ganglia neurons or rat pheochromocytoma PC12 cells with a spontaneously immortalized rat Schwann cell line IFRS1（Sango K, et al., 2011, 2012）. In the present study we performed cocultures of rat neural stem cell（NSC）-derived neurons or mouse ES cell-derived motoneurons with IFRS1 Schwann cells to establish myelinating cultures between these cell lines. For preparation of a rat stable NSC line, adult rat brain stem tissues were dissociated and cultured in Neurobasal medium containing B27, 10 ng/ml of FGF2 and 10 ng/ml of EGF, and growing neurospheres were serially passaged. To differentiate the cells into neurons, dissociated NSCs were maintained in F12 medium containing 100 nM of retinoic acid（RA）. For preparation of mouse ES cell-derived motoneurons, embryoid bodies derived from a mouse ES cell line NCH4.3 were differentiated in DFK5 medium containing 100nM of RA and 100 nM of SAG. These NSC-derived neurons or ES-derived motoneurons were mixed with IFRS1 Schwann cells at 1：2-4 of the cell density ratio, plated, and maintained in F12 medium containing B27, 50 μg/ml of ascorbic acid and 10 ng/ml GDNF. So far, myelin formation was demonstrated by electron microscopy at 4 weeks of coculture of rat NSC-derived neurons and IFRS Schwann cells. The present coculture system utilizing the stable cell lines can be useful in studies of peripheral nerve degeneration and regeneration. |
| P2-16
成体神経幹細胞ニッチとしての斑点状基底膜の機能
佐藤 祐哉1，浄住 大慈1，二木 杉子1，中野 伊津子1，金子 奈穂子2，澤本 和延2，関口 清俊1
大阪大学 蛋白質研究所 細胞外マトリックス研究室1，名古屋市立大 医学研究科 再生医学分野2
【背景・目的】基底膜は主に上皮細胞の直下に存在するシート状の細胞外マトリックスであり、組織幹細胞の挙動を制御する幹細胞ニッチの一つとして着目されている。成体の神経幹細胞は側脳室の直下（脳室下帯；subventricular zone、SVZ）などに存在し、そのニッチとして上衣細胞や血管などが報告されている。しかしながら、神経幹細胞のニッチとして基底膜が機能しているのかどうか、不明な点が多く残されている。本研究では、マウスSVZホールマウント染色法によって、神経幹細胞と基底膜との関係を精査することを目的とした。【結果・考察】生体内の全ての基底膜を検出する抗ラミニン抗体を用いて、成体マウスSVZホールマウント染色を行ったところ、上衣細胞の細胞間および直下に斑点状の基底膜が存在することがわかった。この斑点状の基底膜にはラミニンα3、5鎖が含まれており、ラミニンα2、4、5鎖から構成される血管基底膜とは組成が異なっていた。また、上衣細胞層に存在するGFAP陽性細胞の80％が斑点状の基底膜と共局在していた。斑点状基底膜の形成時期を時系列的に追跡したところ、生後5-10日目頃に形成されることがわかった。この斑点状の基底膜を産生する細胞種を同定するために、ラミニンα5鎖のコンディショナルノックアウトマウスを作製した。その結果、神経幹細胞/アストロサイト特異的なGfap-Creマウスにおいて、斑点状基底膜に対するラミニンα5鎖の蓄積が顕著に低下することがわかった。さらに、ラミニンのインテグリン結合能を消失させるようなコンディショナルノックインマウスでは、斑点状基底膜の数や大きさが有意に減少することがわかった。以上の結果は、斑点状基底膜は神経幹細胞/アストロサイトが産生する基底膜であり、その形成にインテグリンとラミニンとの相互作用が関与していることを示している。また、上衣細胞層に存在するGFAP陽性細胞との共局在が見られたことから、斑点状基底膜が成体神経幹細胞の足場として機能している可能性が示唆される。 |
| P2-17
神経細胞系譜への分化に関わるヒストンH2Bモノユビキチン化の解析
福家 聡1，石野 雄吾2，林 恵子3，中林 一彦3，池中 一裕2，等 誠司1
滋賀医科大・生理学・統合臓器生理学1，生理研・分子神経生理2，成育医療研究センター・周産期病態3
Modifications of histone proteins, which are the protein components of chromatin, have been thought to play an important role in cell fate decision and maintenance during development and differentiation as well as DNA methylation. The histone H2B mono-ubiquitylation is known as one of these epigenetic regulations, and affects gene expression through regulation of chromatin structure due to the presence of ubiquityl-H2B（H2Bub）. Bre1a（RNF20）protein, a histone H2B ubiquitin ligase, regulates the mono-ubiquitylation of H2B and would modulate Notch-signaling, but the details of Bre1a-H2Bub cascade have not been clarified. We previously reported that knockdown of Brea1 in the ventricular zone prolonged the cell cycle of neural precursor cells and keep the cells in an undifferentiated state in mice. It suggests that the Bre1a-taget gene play an important role for proliferation and differentiation of neural stem cells（NSCs）in vivo. In this study, to reveal a physiological significance of the mono-ubiquitylation of H2B in the neural cell linage, we analyzed about Bre1a-deficient mouse. However, homozygous Bre1a-deficient mice were embryonic lethal in early development. Moreover, in analysis about embryonic stem（ES）cells derived from Bre1a mutant blastocysts at embryonic day 3.5（E3.5）, decreased expression of Bre1a induced attenuation of the cell growth and tendency of ES cell to differentiate into cells of the NSC lineage. To identify the Bre1a-target genes, we performed the chromatin immunoprecipitation（ChIP）assay with anti-H2Bub antibody from Bre1a-deficient ES cells and DNA analysis by the next-generation sequencing. The present findings would provide insight into the epigenetic regulations of proliferation and differentiation of stem cells. |
| P2-18
脳微小血管内皮細胞由来のエクソソームはオリゴデンドロサイト前駆細胞の生存・増殖・遊走を促進する
倉知 正1，飯島 圭哉2，好本 裕平2，三國 雅彦3，石崎 泰樹1
群馬大学大学院医学系研究科分子細胞生物学1，群馬大学大学院医学系研究科脳神経外科学2，群馬大学大学院医学系研究科神経精神医学3
我々はこれまでに、ラット白質梗塞に対する脳微小血管内皮細胞（MVECs）移植の効果を検討し、MVECs移植が梗塞巣の再髄鞘化を促進することを明らかにした。本研究ではMVECs移植による白質梗塞改善の分子機構を明らかにすることを目的として、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCs）に対するMVECs由来エクソソーム（exosome）の効果をin vitroで検討した。成体SDラット大脳より調製した初代培養MVECsの培養上清から、エクソソーム分離試薬を用いてMVECs由来のエクソソームを抽出した。また、OPCsは幼若SDラット大脳皮質からimmunopanning法によりO4陽性細胞として分離し、PDGF存在下に数日間培養した後に実験に用いた。MVECs由来のエクソソームがOPCsに取り込まれるかを確認するため、エクソソームを膜標識色素PKH67で標識してOPCs培養系に添加した。添加後2時間以内にOPCs内に色素標識された多数の顆粒状構造体が認められたことから、MVECs由来のエクソソームがOPCsに容易に取り込まれることが明らかとなった。MVECs由来のエクソソームによるOPCsの生存・増殖調節を検討するため、エクソソームがOPCsの細胞死およびBrdU取り込み能に及ぼす効果を調べた。培養3日目において、エクソソーム存在下のOPCsの細胞死は対照群に比べて有意に抑制された。またエクソソーム存在下において多数のBrdU陽性細胞が認められた。さらにOPCsの遊走能に対するエクソソームの効果を調べるために、OPCsを再凝集化して播種し、一定時間後におけるOPCsの遊走距離を評価した。対照群と比較して、エクソソーム存在下でOPCsの遊走距離は長くなった。これらの結果はMVECs由来のエクソソームがOPCsの生存・増殖ならびに遊走を促進している可能性を強く示唆した。MVECs由来のエクソソームに含有される分子を解析することにより、MVECs移植による白質梗塞改善の分子機構の詳細を明らかにすることができると考えられる。 |
| P2-19
海馬ニューロンの新生・分化におけるBRINP1の役割
小林 三和子，松岡 一郎
松山大学・薬・生理化学
We have previously reported that BRINP（BMP/RA-inducible neural-specific protein-1, 2, 3）family genes are expressed in adult mouse brain. Each BRINP possesses an ability to suppress cell cycle progression in cultured neural stem cells. Among the three family members, BRINP1 is most highly expressed in various brain regions including hippocampus and its expression is further up-regulated by intraperitoneal administration of kainic acid, especially in dentate gyrus. BRINP1-KO mice exhibited abnormal behaviors with an increase in locomotor activity, reduced anxiety-like behavior, poor social interaction and slight impairment of working memory, which are relevant to symptoms of human psychiatric disorders such as schizophrenia and ADHD. In the present study, we examined the involvement of BRINP1 in neurogenesis and neuronal development in hippocampus. We found that the incorporation of BrdU in SGZ of BRINP1-KO mice was increased about 2-fold of wild-type mice. The excess newborn cells in SGZ differentiated to doublecortin-expressing neuroblast, but the number of BrdU/calbindin double positive neurons in BRINP1-KO mice was as same level as in wild-type mice. Loss of BRINP1 did not affect the expressions of glial markers（GFAP, MBP, Iba1）and the expression of GAD67, a marker for GABAergic inhibitory interneuron in hippocampal region. On the other hand, the number of large size parvalbumin-expressing neurons in CA1 subregion in BRINP1-KO mice was 1.65-fold greater than that in wild-type mice. These data suggest that the lack of BRINP1 causes abnormal hippocampal circuitry in both dentate gyrus and CA1 subregions which may eventually lead to the abnormal mouse behaviors. | | | |
|
|
