| 回路形成/大脳皮質形成 |
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| P3-10
網膜ミュラー細胞は網膜神経節細胞のP2Y6受容体活性化を介して軸索伸展を促進する
篠崎 陽一1,3，田口 備教1，柏木 賢治2，小泉 修一1,3
山梨大学大学院医学工学総合研究部薬理学講座1，山梨大学大学院医学工学総合研究部眼科学講座2，独立行政法人科学技術振興機構 戦略的創造研究推進事業3
緑内障は日本人における失明原因の第一位の疾患である。その主な原因として、眼圧上昇による網膜神経節細胞（RGC）の軸索機能低下とそれに伴うRGCの細胞死が挙げられる。近年、グリア細胞がRGCを含む神経細胞の軸索機能調節や生存に寄与する事、特にATPなどグリア伝達物質がその中心的な役割を果たす事が報告されている。本研究では網膜グリア細胞であるミュラー細胞によるグリア伝達を介したRGC軸索機能調節作用を検討した。RGC軸索伸展に対する各種P2受容体アゴニスト/アンタゴニストの作用から、伸展促進にはP2Y6受容体が関与することが明らかとなった。定量的RT-PCR及びウェスタンブロットより初代培養RGCのP2Y6受容体発現が見られ、Ca2+イメージング法によりRGCのP2Y6受容体が機能的である事を確認した。また、in situハイブリダイゼーションによりアダルトマウスの網膜神経節細胞層にP2Y6受容体の発現が確認された。RGCの軸索伸展はミュラー細胞との共培養や上清添加によって促進され、この作用はP2Y6受容体ノックアウトマウス由来RGCでは観察されず、ミュラー細胞由来液性因子がRGCのP2Y6受容体を活性化すると考えられた。高速液体クロマトグラフィーによる解析から、ミュラー細胞はP2Y6受容体に対する内在性アゴニストUDPの前駆体であるUTPを放出する事が明らかとなった。緑内障との関連を調べるため、遠心による圧負荷を用いたin vitro緑内障モデルで検討した。圧負荷により、RGCのP2Y6受容体の発現は低下し、RGCの軸索伸展は有意に抑制された。一方、P2Y6ノックアウトRGCでは、圧負荷によるさらなる突起伸展抑制は認められなかった。以上より、網膜ミュラー細胞はUTPを放出し、その分解産物UDPがP2Y6受容体を刺激することでRGCの軸索伸展を誘導すること、眼圧亢進によりRGCのP2Y6受容体発現が低下することで軸索障害が起こる可能性が示された。 |
| P3-11
Rho-kinaseによる神経細胞の極性形成・維持機構の解明
高野 哲也，中牟田 信一，グゥ チュンディ，難波 隆志，天野 睦紀，貝淵 弘三
名古屋大学医学系研究科神経情報薬理学
Neurons are highly polarized cells with structurally and functionally different processes, an axon and several dendrites. One of minor neurites begins to extend rapidly and differentiates into the axon. During the axonal outgrowth, minor neurites consistently grow and retract to prevent multiple axon formation, thereby maintaining neuronal polarity. However, the molecular mechanisms that maintain neuronal polarity remain largely unknown. Here, we found that retrograde long-range Ca2+ signaling regulates the maintenance of neuronal polarity by increasing RhoA/Rho-kinase activity thorough GEF-H1/Lfc, a RhoA-specific guanine nucleotide exchange factor（GEF）, in a Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I（CaMKI）-dependent manner. The minor neurites were retracted by local application of Ca2+ ionophore to axon terminal, probably through the propagation of Ca2+ wave to soma and/or minor neurite. The Ca2+ influx increased the kinase activity of Rho-kinase in neurons. Local application of Rho-kinase inhibitor to minor neurite induced rapid elongation and subsequent multiple axon formation. Moreover, we found that CaMKI phosphorylated GEF-H1 in vitro and in vivo. The phosphorylation of GEF-H1 by CaMKI markedly increased its GEF activity. Taken together, these results suggest that the long-range Ca2+ signaling from axon terminal activates CaMKI and thereby phosphorylates GEF-H1 at other minor neurites. This phosphorylation appears to activate the GEF-H1 activity and in turn to stimulate the RhoA-Rho kinase activity to prevent the neurite elongation. |
| P3-12
神経活動に伴うアストロサイトの形態変化
辰巳 晃子，森田 晶子，奥田 洋明，和中 明生
奈良県立医科大学・医・第2解剖学講座
The basal ganglia control activities of motor cortex. Recently we found Olig2-expressing astrocytes in the basal ganglionic nuclei including the globus pallidus（GP）. Given the distribution pattern and so-called"tripartite synapse theory", these Olig2+ astrocytes may modulate neuronal activities under exercise stimuli. To test the hypothesis, we first focused on the relationship between astrocytic morphologies and voluntary exercise, using olig2-CreER/ROSA-EGFP-GAP43 double transgenic mice that express membrane-targeted EGFP in the olig2-positive cells. Mice were divided into three groups；first group of mice were kept in a cage with a locked running wheel to limit the exercise（Control）and second group of mice were given a free running wheel for voluntary exercise（Runner）for three weeks. Some mice in the B group were kept additional three weeks with locked running wheel（Runner-Rest）. As expected, the more complex the astrocytic process arborization became after voluntary running, the more EGFP fluorescence per area increased. Taking advantage of this phenomenon, we measured average fluorescence intensity of an astrocyte and extrapolated the complexity of the astrocytic morphology from the intensity. The EGFP-fluorescence intensities of astrocytes in the GP are significantly greater in the runner-group than those of control-group. Interestingly, fluorescence intensities of runner-rest group tended to decrease, suggesting that the morphological changes may be plastic in response to motor activities. Furthermore, we observed fine processes of olig2+ astrocytes frequently surrounded synapses and construct'tripartite synapse'in immuno-electron microscopic analysis. |
| P3-13
Dpy19ファミリーによる大脳新皮質の発生制御
渡辺 啓介1，周 麗2，備前 典久1，阿部 学2，夏目 理恵2，崎村 建司2，竹林 浩秀1
新潟大・医・神経解剖1，新潟大・脳研・細胞神経生物2
大脳皮質は哺乳類で飛躍的な進化を遂げた領域である。新皮質は6層構造を呈し、層構築を含めた神経回路網形成は発生段階で厳密に制御されている。複雑なネットワーク構築を行うため、哺乳類特有の発生プログラムの存在が予想されるが、不明な点が多い。我々はこれまで、発生期大脳皮質に強く発現する遺伝子の網羅的スクリーニングを行い、膜タンパク質Dumpy19 like1（Dpy19L1）が、発生期大脳皮質の興奮性神経細胞に強く限局して発現し、神経細胞の移動に関わることを見出した。Dpy19は、哺乳類では4つの遺伝子からなるファミリー（Dpy19 Like1～4）を形成するが、既知の機能ドメインをもたず、分子作用機序は不明である。そこで、Dpy19L1をCOS-7細胞に発現させ細胞内の局在解析を行った結果、Dpy19L1タンパク質が核周囲、小胞体に局在することがわかった。さらに、ウェスタンブロットや微小管重合阻害実験を行った結果、Dpy19L1が細胞骨格系、特に微小管と強い関連をもつことが示唆された。次に、大脳皮質形成におけるDpy19の役割を明らかにするため、Dpy19L1ノックアウト（KO）マウスを作製し個体レベルでの解析を試みた結果、80%程度のDpy19L1 KOマウスが生後1日の間に致死になることが明らかになった。さらに生き残ったKOマウスは、野生型と比較すると顕著な低体重、また脳の大きさの減少がみられた。組織学的解析により、Dpy19L1 KOマウスにおいて前交連の投射パターンなど軸索投射異常や細胞構築異常が観察された。これらの結果から、Dpy19L1が神経細胞の形態形成に関わり、脳形成に重要な働きを持つこと、産仔の生存・発達に重要な働きを果たすことが示唆された。 |
| P3-14
自閉症原因遺伝子A2BP1の大脳皮質形成における機能解析
永田 浩一，浜田 奈々子，伊東 秀記，田畑 秀典
愛知県心障者コロニー・発達障害研・神経制御
A2BP1は、alternative splicing制御因子であり、神経組織の分化、発達、さらに神経機能発現において必須の役割を担うと考えられている。実際、A2BP1遺伝子の欠失や重複が、自閉性障害（ASD）、知的障害、てんかん等の発達障害患者から多数同定されている。しかしA2BP1の機能不全が発達障害の病態を形成するメカニズムについては全く知見がない。そこで、ASDにおけるA2BP1の病態学的意義を理解するために、発達期の大脳皮質形成過程におけるA2BP1の機能を解析した。子宮内胎仔脳遺伝子導入法（in utero electroporation）を用いて、発達期のマウス大脳皮質でA2BP1の神経特異的アイソフォームA016、A030をそれぞれ発現抑制し、固定切片を作成して観察したところ、どちらの発現抑制においても神経細胞の移動障害が観察された。一方、同じファミリーに属するFox2/3を発現抑制しても神経細胞の移動障害は起こらなかった。また、A2BP1（A016およびA030）の発現抑制は、脳室帯の幹細胞の細胞周期には影響を与えなかった。さらに、A2BP1（A016およびA030）の発現抑制の結果、発達期における皮質神経細胞の軸索伸長および対側皮質への進入が抑制された。そこで、移動障害の実態を詳細に解析するために共焦点顕微鏡ライブイメージングを行った。その結果、A2BPの機能が阻害された大脳皮質神経細胞では、1）中間帯から皮質へ移行できない、2）皮質へ移行できた場合にも大脳皮質表面に向かう移動が遅れる、という表現型が観察された。神経細胞の移動機構の1つには中心体による核の引き上げがあるが、移動中の神経細胞の核と中心体の距離を測定したところ、A2BP1ノックダウン細胞でこの距離が長くなっていたことから、移動障害は中心体による核の引き上げが障害されたためと示唆された。以上の結果より、大脳皮質神経細胞の移動障害、軸索伸長抑制がA2BP1の引き起こす自閉症、知的障害の背景となっている可能性が示唆された。 | | | |
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