S31-1
AAVを利用した線条体ドーパミン制御機構の解析：volume transmissionのメカニズム
一瀬 宏
東京工業大学大学院生命理工学研究科
ドーパミンニューロンは運動や情動の制御に関わっていることが広く知られており、パーキンソン病や統合失調症などの神経・精神疾患と深く関わっている。ドーパミンの生合成は律速酵素であるチロシン水酸化酵素（TH）の活性により制御されていると考えられてきた。しかし、THが律速酵素であることは、副腎や副腎髄質由来のクロマフィン細胞で証明されてきたことであり、脳内ドーパミン量について、THが律速であることを直接証明する研究はなされていなかった。我々は、AAVを利用して成獣の脳で誘導的にTH発現量を変化させることにより脳内ドーパミン量がどのように変化するか検討した。まずTH遺伝子を、DNA組換え酵素Creにより誘導的に遺伝子破壊できるfloxTHマウスを用いて、成獣となってからTH遺伝子を中脳で破壊する実験を行った。AAV-Creを片側黒質にマイクロインジェクションすることにより、線条体THタンパク質量を非投与側の約40％に低下させた。この際、約70％の線条体ドーパミンは残存しており、THの減少よりドーパミンの減少は小さいことが判明した。[Tokuoka et al.（2011）J. Biol. Chem]次に、AAV-THを成獣の黒質に投与することによりTHの過剰発現を行った。中脳・線条体でTHタンパク質量は非投与側の2－5倍に増加した。この時、中脳ドーパミン量はTHタンパク質量の増加と相関して増加したが、線条体ドーパミン量は全く変化しなかった。このときドーパミン代謝産物はやや増加したが、増加率は非投与側の約1.5倍程度であった。以上の結果は、細胞体のある黒質と神経終末のある線条体ではドーパミン量の制御機構が異なることを示唆した。今後、神経終末でのドーパミン制御機構を解明することは、新規の精神神経疾患治療薬の開発につながることが期待できる。 |
| S31-2
AAVベクターを用いた新規薬物依存関連分子TMEM168のドパミン作動性神経の関連と生理機能解明
新田 淳美，傅 柯ぜん，宮本 嘉明
富山大学大学院医学薬学研究部・薬物治療学研究室
我々は、覚せい剤依存モデルマウスの側坐核で発現量が増加している分子としてShati/Nat8l、PiccoloおよびTMEM168を見出した。特にTMEM168は、そのアミノ産配列から膜貫通領域を10回前後持つことが予想され、複雑な構造をしていると考えられ、単離や抗体の作成が非常に難しく、生化学的な実験の実施が困難であった。そこで、AAVベクターを用いて、同分子の機能をin vivoレベルで検討を行うことで、表現型から生理機能を明らかとし、その結果を踏まえ、結合タンパクの同定など分子レベルでの機能に迫ることとした。AAVに本遺伝子を組み込み、8週令のC57BL/6Jマウスの側坐核に注入した。RT-PCR法やin situ hybridization法でTMEM168 mRNAの発現増加を確認した上で、行動実験を行った。本マウスは、不安症状が増加しており、それらの症状は抗不安薬であるジアゼパムで抑制された。聴覚性驚愕反応試験におけるプレパルス抑制の減弱を示し、統合失調症薬のリスペリドンで抑制された。In vivoマイクロダイアリシスを用いた実験では、ドパミンの基礎遊離量は変化していなかったが、メタンフェタミンによる増加は抑制されていた。一方で、GABAの遊離量は有意に減少しており、高K+刺激での遊離量増加率も低かった。また、薬物依存形成におけるTMEM168の効果を検討したところ、側坐核で増加させたマウスでは、メタンフェタミンによる運動過多抑制されていた。場所嗜好性試験でも、TMEM168過剰発現マウスの嗜好性はコントロールマウスより減少していた。以上のことより、TMEM168という今まで全く機能が分かっておらず、抗体を得ることができていない新規分子であっても、AAVベクターを用いた実験で、不安症や情報統合能力が低下させる生理機能を持つこと、また、覚せい剤による薬物依存を抑制することを明らかにした。これらの結果から、本分子が神経伝達物質の放出や遊離を調整するという機能を有することが明らかとなった。今後は、神経伝達物資の遊離と関係しているタンパク質との関係を明らかにしていくことで、より詳細なメカニズムが明らかになると考えられる。 |
S31-3
アルツハイマー病原因解明や治療方法確立へのAAVの利用
岩田 修永
長崎大院・医歯薬・ゲノム創薬学
Accumulation of amyloid-β peptide（Aβ）in the brain is a triggering event of the pathological cascade of Alzheimer's disease（AD）, and are closely associated with the metabolic balance between Aβ anabolic and catabolic activities. Neprilysin（NEP）is a rate-limiting peptidase involved in brain Aβ catabolism. Mounting evidence that expression levels of NEP are decreased in the hippocampus and cerebral cortex of AD patients from the early stages of disease development and also with aging in humans, suggests a close association of NEP with the etiology and pathogenesis of AD. Thus, a subtle but long-term decline in NEP activity appears to be at least partly responsible for the memory-related symptoms, and up-regulation of NEP is considered to be a promising strategy for therapy and prevention of AD. In current gene therapy for central nervous system diseases, a viral vector carrying a therapeutic gene has been injected directly into the brain through a pinhole drilled in the skull. However, such injection is not easy, and is not necessarily appropriate if the therapeutic gene should be delivered to broad areas of the brain. More efficient and global delivery is necessary to treat the broadly distributed amyloid burden in AD. We have successfully developed an AAV vector capable of providing neuronal gene expression throughout the brains after peripheral administration. A single intracardiac administration of the vector carrying NEP gene in AD-model mice elevated NEP activity broadly in the brain, and reduced Aβ oligomers, with concurrent alleviation of abnormal learning and memory function. AAV vector-mediated gene transfer would provide a therapeutic strategy for neurodegenerative diseases, where global transduction of a therapeutic gene into the brain is necessary. |
| S31-4
孤発性ALS分子病態モデルマウスを用いたALSの遺伝子治療
郭 伸1,2
東京大院・医・臨床医工1，国際医療福祉大・臨床医学研究センター2
Motor neurons of patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis（ALS）express abnormal GluA2（an AMPA receptor subunit）that has glutamine（Q）at the Q/arginine（Q/R）site. All of the GluA2 expressed in the central neurons have R at this site due to adenosine to inosine conversion of the pre-mRNA（RNA editing）, which is specifically catalyzed by adenosine deaminase acting on RNA 2（ADAR2）. Motor neurons devoid of ADAR2 activity undergo slow degeneration resulting from expression of abnormally Ca2+-permeable AMPA receptors that contain Q/R site-unedited GluA2 in the conditional ADAR2 knockout（AR2）mice, a mechanistic mouse model of sporadic ALS. ADAR2 underactivity in the motor neurons therefore is likely involved in the ALS pathogenesis, and enhancement of ADAR2 activity in the motor neurons would be a therapeutic strategy for ALS. Here, we attempt to enhance ADAR2 activity broadly in the motor neurons in the brainstem and spinal cord by the delivery of the ADAR2 gene using a vascular type adeno-associated virus serotype 9（AAV9）vector. One-shot intravenous injection of the AAV9-ADAR2 vector rescued ALS-like progressive motor dysfunction and effectively prevented motor neurons from death in AR2 mice. Moreover, ALS-like TDP-43 pathology observed in motor neurons of untreated AR2 mice was normalized and motor neurons that expressed exogenous ADAR2 exhibited normal nuclear TDP-43 immunoreactivity in the treated AR2 mice. This AAV9-mediated ADAR2 gene delivery may therefore enable the development of a gene therapy for ALS. Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas from The Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology（MEXT）. |
