| 幹細胞・細胞分化 |
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| P1-16
発達初期段階におけるヒトiPS細胞由来神経細胞の薬剤開発への応用
大津 真生1，山崎 博幸1，六本木 麗子1，小金澤 紀子1，大原 由貴1，佐藤 薫2，関野 祐子2，白尾 智明1
群馬大学大学院医学系研究科神経薬理学1，国立医薬品食品衛生研究所薬理部2
Induced pluripotent stem cells（iPSCs）are expected to be useful tools in an innovative drug-development and a safety test of new medications. In this study, we performed validation tests of the 8 drugs（drug A－drug H）using human iPSCs-derived neurons（iCell Neurons, Cellular Dynamics International Inc.）. The drugs are commercially available medicines, and they have been known to cause side effects on cardiovascular system. We applied the drugs to iCell Neurons at 1 day in vitro（DIV）and evaluated their development at DIV 2. The drug-treated neurons were fixed and immunolabeled by MAP2（dendritic marker）, phosphorylated-neurofilament（axonal marker）, and drebrin（actin-binding protein）antibodies. The application of 10 μM-drug C significantly decreased the neurite length compared with control group. On the other hand, drebrin localizations in growth cones were not affected by all drugs used in this study. Since we detected a significant change in morphology in the early developmental stage of iCell Neurons, our results indicate that human iPSCs-derived neurons are applicable in a safety test for drug development. |
| P1-17
神経幹細胞の増殖と分化におけるKrüppel-like factor 5の役割
渕上 孝裕1，林 義剛1，黒田 杏理1，石田 正平1，依馬 正次2，等 誠司1
滋賀医科大・生理学・統合臓器生理1，滋賀医大・動物科学研究センター2
Krüppel-like factor（Klf）5 is a member of Klf family proteins, which are members of DNA-binding transcriptional factors with highly conserved sequences and overlapping functions in cell proliferation, differentiation and development. Among them, Klf4 is one of the defined factors which reprogram somatic cells to induced pluripotent stem cells（iPS cells）. Klf4 is also related to ES cells self-renewals, inner-cell mass（ICM）development and neural stem cells（NSCs）proliferation. Klf5 shows functional redundancy with Klf4 in the induction of iPS cells and ES cells self-renewals. Klf5 is shown to be essential for blastocyst and the three germ layers development, but its roles in the neurogenesis have not been examined.In this study, we performed neurosphere assay to investigate the roles of Klf5 in neurogenesis. We found that conditional knockout of Klf5 results in the impairment of self-renewals of NSCs. We also found that knockdown or overexpression of Klf5 by in utero electroporation induced abnormal differentiation and migration of neural precursor cells in the developing brain. Additionally, aberrant BrdU incorporation was observed in these brains. These results suggest that Klf5 regulates the proliferation, differentiation and neural migration of neural precursor cells. |
| P1-18
ニーマンピック病C型脳オリゴデンドロサイトにおける分化関連マイクロRNAの解析
岸 宗一郎，河内 全，細川 昌則，榎戸 靖
愛知県コロニー・発達障害・病理
ニーマンピック病C型（NPC）は、後期エンドソーム／リソゾーム（LEs/LYs）を介した細胞内コレステロール輸送の異常で生じる劣性遺伝子疾患であり、進行性の神経変性と髄鞘形成不全を神経学的特徴とする。これまでNPCの髄鞘形成不全には、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）からオリゴデンドロサイト（OL）への分化異常が関係することが知られるが、そのメカニズムは不明である。一方、オリゴデンドロサイトの分化がいくつかのマイクロRNA（miRNA）によって制御されていることが最近明らかになり、それらのヒト疾患への関与が注目されている。以上の背景から、本研究ではNPCで見られるオリゴデンドロサイト分化異常とmiRNAの関係を解析した。まず、LEs/LYsを介する細胞内コレステロール輸送阻害剤であるU18666A処理した初代培養OPCを分化誘導し、オリゴデンドロサイト分化関連miRNAの発現および細胞分化の様子を調べた結果、miRNAならびにOL分化マーカー遺伝子の発現が著しく抑制されることを見出した。さらにNPCモデルマウスであるNPC1遺伝子ノックアウトマウス脳組織内においても同様にmiRNA発現の著しい低下が観察された。以上の結果は、LEs/LYsを介した細胞内コレステロール輸送がオリゴデンドロサイトの分化制御に関与するとともに、それらの異常が髄鞘形成不全の原因である可能性を示唆している。 |
| P1-19
成体脳の側脳室下帯由来神経系幹・前駆細胞におけるルテニウムレッド感受性チャネルによる分化調節
芝 達雄，米山 雅紀，荻田 喜代一
摂南大学薬学部薬理学研究室
Subventricular zone（SVZ）of adult brain has neural stem/progenitor cells（NPCs）that generate new neurons throughout life. In the NPCs, intracellular Ca2+ is known to play a critical role in regulating different stages of early brain development and neurogenesis. In the present study, we evaluated the effect of blockers for different types of Ca2+ channels on differentiation in the NPCs of adult mouse SVZ. Cells were prepared from the SVZ of 5-week-old male mice and then primarily cultured in DMEM/F12 medium with EGF and bFGF for 8-11 days in vitro（DIV）. To differentiate the cells, the cells were cultured in differentiation medium at 1 DIV after replating. Exposure of the cells to ruthenium red induced morphological change with elongating process in the cells even under proliferative conditions in the presence of the growth factors. However, MK-801, nifedipine, 2-aminoethoxydiphenyl borate, or dantrolene did not affect the changes in cell morphology. Un the same experimental conditions, exposure to ruthenium red for 1 days resulted in a decrease in the level of EGF receptors, as well as an increase in the phosphorylation level of ERK1/2 of the NPCs. The NPCs had the ability to differentiate into astrocytes or neuronal cells under the experimental conditions for differentiation. Under the differentiation conditions, ruthenium red produced an increase in the number of GFAP-positive cells, but conversely a decrease in the number of β-tublin III-positive cells. Ruthenium red was effective in down-regulating the gene level of both Hes5 and Math1 under the same conditions. These results suggest that ruthenium red sensitivity channels are involved in commitment for glial differentiation in the NPCs derived from adult mouse SVZ. |
| P1-20
光血栓性大脳皮質虚血モデルにおける新生ニューロンの移動様式の解析
松本 真実，澤田 雅人，澤本 和延
名古屋市立大学大学院医学研究科再生医学分野
成体脳の脳室下帯には神経幹細胞が存在し、常に新生ニューロンが産生されている。産生された新生ニューロンは鎖状に連なり、吻側移動経路を通って嗅球まで高速で移動し、既存の神経回路に組み込まれる。一方、線条体に脳梗塞などの傷害が生じると、脳室下帯の新生ニューロンが傷害部に向かって移動し、その一部が成熟することを当研究室から報告しており、脳室下帯の神経幹細胞を用いた脳再生の可能性が期待されている。これまでの研究から、成体大脳皮質の傷害においても新生ニューロンが傷害部周囲に出現することが報告されている。しかし、新生ニューロンの脳室下帯から傷害部位への移動様式および周囲の環境との関係については不明である。そこで本研究では、簡便かつ再現性の良い大脳皮質傷害モデルを作製し、脳室下帯から傷害部へ向かう新生ニューロンの移動様式および周囲の環境との関係について解析することを目的とした。
成体の大脳皮質に脳傷害を作製するために、光感受性色素ローズベンガルによる光血栓性大脳皮質虚血モデルを用いた。ローズベンガルを成体マウスの静脈内に注入し、緑色光を特定の大脳皮質領域に選択的に照射することで、血栓性の梗塞巣が再現性よく作製された。既に報告されているように、大脳皮質の虚血に応答して、梗塞巣およびその周囲では炎症反応が生じ、アストロサイトやミクログリアの活性化が観察された。興味深いことに、虚血後に梗塞巣周囲で観察された新生ニューロンの一部は、鎖状の塊を形成していた。また、梗塞巣の周囲において、血管に接触している新生ニューロンも観察された。以上の結果から、大脳皮質の傷害後において、新生ニューロンは正常脳と同様に集団で移動し、周囲の環境と相互作用しながら傷害部へ向かう可能性が示唆された。 | | | |
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