一般、大学院生、若手研究者（ポスター）

一般、大学院生、若手研究者（ポスター）イオンチャンネル、興奮膜、受容体、輸送体

P-001（1）繊毛疾患関連遺伝子の変異がGタンパク共役型受容体の繊毛局在に及ぼす影響三好耕^1,2，韓薩日娜¹，鹿田星¹，天野元揮¹，佐藤大樹¹，高村明孝^1,2，松崎伸介³，片山泰一¹ ¹大阪大院・連合小児発達・分子生物遺伝学，²大阪大院・連合小児発達・子どものこころ，³和歌山県立医大・薬理学ほとんどの脊椎動物細胞が、1次繊毛と呼ばれる細胞表面の突起を1本持つことが知られている。1次繊毛は細胞周囲環境の化学的・物理的刺激を感知して細胞体に伝える「細胞のアンテナ」としての機能が近年注目されている。齧歯類において脳の各領域のニューロンが1本持つ1次繊毛には、ソマトスタチン3型受容体、メラニン凝集ホルモン1型受容体、ニューロペプチドY2型受容体等の特定のGタンパク共役型受容体がアデニル酸シクラーゼ3型と共に局在することが報告されている。これはニューロンの1次繊毛が、内包するGタンパク/cAMP signaling cascadeにより非シナプス性の神経伝達を担う可能性を示唆する知見であるが、その機序は不明な点が多い。本研究では、hTERT-RPE1細胞におけるGタンパク共役型受容体とその変異体の1次繊毛への局在を免疫蛍光染色法で観察することにより、繊毛局在に関与する受容体内ドメインを解析した。セロトニン6型受容体では、第3細胞内ループおよびカルボキシル末端ドメインが、受容体の繊毛局在に寄与することが示唆された。1次繊毛の機能異常が惹起するとされるBardet-Biedl症候群、Joubert症候群等の繊毛疾患（Ciliopathy）は、網膜変性、腎障害、多指症、知的障害、発達障害等の症状を呈し、多数の原因遺伝子が報告されている。本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いて繊毛疾患原因遺伝子にbiallelicな変異を持つhTERT-RPE1細胞株を作製し、これらの変異細胞株におけるGタンパク共役型受容体の繊毛局在を観察した。Bardet-Biedl症候群原因遺伝子に変異を持つ細胞株では、受容体の繊毛局在が影響を受けることが示された。		P-002（1） A new assay method for the pharmacological activities of N-methyl-D-aspartate-type receptor antagonists detected in illegal products 重本―最上由香里¹，佐藤薫¹，干川和枝¹，清水英雄¹，木倉―花尻瑠璃²，袴塚高志²，関野祐子¹ ¹国衛研・薬理，²国衛研・生薬 Recently, new psychoactive substances（NPS）that have inhibitory activity of the N-methyl-D-aspartate type of the glutamate receptors（NMDARs）, appeared in the illegal drug market in Japan. In this study, in order to evaluate the pharmacological activities of two newly emerged NPS；4-［1-（3-methoxyphenyl）cyclohexyl］morpholine（3-MeO-PCMO）and 2-（3-Methoxyphenyl）-2-（methylamino）cyclohexanone（Methoxmetamine）, a new quantitative evaluation system of the inhibitory activities on NMDARs of these substances was established using primary cultures of hippocampal neurons prepared from P0 rats. Intracellural Ca2+ changes induced by L-glutamate（L-Glu）were observed in the neurons loaded with Fura2-AM. We have customized this Fura-2 method to evaluate the inhibitory activities on NMDARs of the NPS. Using this method, the concentration-dependent inhibitory effect of AP5, a NMDAR-specific antagonist, was detectable and its IC50 value was 5.82 nM. The positive controls of two test substances, 3-MeO-PCP（Designated Substance）and ketamine（Narcotic）also showed the concentration-dependent inhibition on NMDARs, and their IC50 values were 474.93 nM and 2.84 μM. On the other hand, the IC50 values of 3-MeO-PCMO and Methoxmetamine were 15.44 nM and 795.78 nM, and they showed greater activities than those of the positive controls. These results suggested that the new assay method used in this study is powerful tool to evaluate the inhibitory effect of NMDARs of the NPS on the neuron.

P-003（1） Ion channels responsible for the resonant property of neurons in the inferior olive. 橋本浩一，中山寿子，松本佳子広島大学・医歯薬保健学研究院・神経生理学 Some neurons in the central nervous system have the ability to enhance output voltage to input current with a preferred frequency, which results from resonance that occurs in circuits that are electrically equivalent to a parallel resonant circuit inherent to the plasma membrane. Although candidate ion channels responsible for resonance have been reported, the precise mechanisms remain largely unknown. In the present study, we examined ion channels involved in resonance in the inferior olivary（IO）neurons. Resonance was reduced but clearly present in Cav3.1 T-type voltage-dependent Ca²⁺ channel knockout（KO）mice. Activation of Cav3.1 channels was strongly membrane potential-dependent, but less frequency-dependent. Remnant resonance in Cav3.1 KO mice was blocked by a hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated（Hcn）channel blocker, ZD7288. The residual resonance was also suppressed by E-4031, a blocker of Kv11 channel, or tetraethylammonium, a broad spectrum Kv channel blockers but the effects were restrictive. Resonance was inhibited by ZD7288 in wild-type mice and impaired in Hcn1 KO mice, suggesting that the Hcn1 channel was essential for resonance. Waveform of the ZD7288-sensitive current was nearly sinusoidal and strongly frequency-dependent. Cav3.1 and Hcn1 expression was revealed as a punctate appearance on IO dendrites, and only occasionally overlapped. These results suggested that Cav3.1 and Hcn1 channels act as amplifying and resonating conductances, respectively.		P-004（1） RGS8tgマウスはMCHR1シグナルの抑制を介して抗うつ様表現型を示す小林勇喜¹，竹本梨紗¹，大和翔吾¹，濱本明恵^1,2，斎藤祐見子¹ ¹広島大学総合科学研究科，²久留米大学分子生命科学研究科 Gタンパク質調節タンパク質（RGS）はGタンパク質αサブユニットと共役し、サブユニットが有するGTPase活性を亢進して、シグナル伝達の抑制に関与する。これまで本研究室において、脳選択的に発現するRGS8は、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）であるメラニン凝集ホルモン受容体1（MCHR1）を含む、数種のうつ不安関連受容体を介したCa²⁺動員能を抑制することを明らかにしてきた。そこで、我々はRGS8の持つ生理作用をより明らかにするために、ラットRGS8が中枢選択的に過剰発現するトランスジェニックマウス（RGS8tg）を作製した。作出したtgマウスを用いて、RGS8 mRNAの発現量を調べたところ、野生型と比較して、RGS8tgの脳ではRGS8 mRNA量の発現が亢進していた。さらにRGS8タンパク質量は、RGS8tgの海馬CA1領域において顕著な発現上昇が認められた。次に、RGS8tgの表現系を明らかにすることを目的としてRGS8tgオス（10週令）を用いて、オープンフィールド試験、社会性行動試験、ストレス誘発高体温試験、強制水泳試験、スクロース嗜好性試験の計5種類のうつ不安様行動試験を実施した。これら試験のうち、強制水泳試験において、うつ様行動の指標となる無動時間がRGS8tgにおいて野生型と比較して有意に減少した。従って、RGS8tgは抗うつ様表現系を有すると考えられる。さらに、MCHR1アンタゴニスト（SNAP7941）を投与した強制水泳試験の結果から、RGS8tgの抗うつ様行動はMCHR1シグナル伝達の抑制を介する可能性が示された。加えて、既存の抗うつ薬であるdesipramineを投与した強制水泳試験からは、RGS8tgの示す抗うつ行動の作用機序が、desipramineの持つ「ノルアドレナリン再取り込み阻害作用」とは異なる経路であることを示唆する結果を得た。以上より、RGS8tgで認められた抗うつ様行動は、CA1領域のMCHR1シグナル抑制が関与すると考えられる。また、RGS8が新たな作用機序を有する抗うつ薬の創薬ターゲットとなることを示唆する結果を得た。即ち、RGS8を標的とした薬剤は、既存の抗うつ薬では奏功しないうつ病患者に有効性を示すこと、また、既存薬との併用により、抗うつ作用を増強することが期待される。

P-005（1）ドーパミンD3レセプターはマウスの特定の不安様行動に関与している飯田諭宜¹，小島孝仁²，永山博通²，田中涼²，森内悠太²，渡辺滋¹，山森早織²，板倉誠²，笹岡俊邦³，宮岡等¹，高橋正身² ¹北里大学医学部精神科学，²北里大学医学部　生化学，³新潟大学脳研究所生命科学リソース研究センター動物資源開発研究分野 Anxiety disorders are one of the most frequent psychiatric illnesses and have a life-time prevalence of 15-20%. To overcome anxiety disorders, the molecular basis for anxiety should be clarified. Although it has been well documented that serotonin was one of the critical factor for anxiety disorders, a role of dopamine has not been evaluated. Previously, we reported quinpirole, a selective dopamine D2/D3 receptor（D2R/D3R）agonist, induced the anxiety-like behaviors of mice in open field test and light and dark preference test. Namely, a percentage of time spent in the central area in open field test and a percentage of time spent in light room in light and dark preference test were reduced after intraperitoneal injection of quinpirole to C57BL/6 mice in dose-dependent manners. Furthermore we showed intraperitoneal injection of quinpirole to D2R-deficient knock-out mouse still induced the anxiety-like behavior in open field-test, however the anxiety-like behavior in dark preference test was not induced. In the present study, we examined effects of PD128907, a selective D3R agonist on the anxiety-like behaviors of mice. The above-mentioned we measured a percentage of time spent in the central area in open field test, and a percentage of time spent in light room in light and dark preference test as the anxiety-like behaviors. Both parameters were reduced after intraperitoneal injection of PD128907 to C57BL/6 mice in dose dependent manners. To further elucidate, we investigated with D3R-deficient knock-out mouse. Intraperitoneal injection of PD128907 to D3R-deficient knock-out mice reduced the percentage of time spent in light room in light and dark preference test, but the percentage of time spent in the central area in open field test was not reduced. Therefore we concluded D3R participate in the expression of the anxiety-like behavior in open field test. In addition, it is suggested that D2R and D3R are related the anxiety-like behaviors through distinct mechanisms.		P-006（1）摂食・情動関連受容体MCHR1を介した1次繊毛縮退機構濱本明恵¹，大和翔吾²，小林勇喜²，児島将康¹，斎藤祐見子² ¹久留米大学　分子生命科学研究所　遺伝情報研究部門，²広島大学大学院　総合科学研究科 1次繊毛とは、脊椎動物のほとんど全ての細胞に存在し、微小管構造を有する突起状の細胞内小器官である。1次繊毛は細胞外環境を鋭敏に感知するアンテナと考えられており、その形成異常は、肥満、腎不全、糖尿病など多岐に渡る疾患を引き起こす。最近、肥満マウス視床下部における神経細胞は1次繊毛の長さが野生型よりも有意に短いことが報告された。従って、繊毛の「長さ」も摂食やエネルギー代謝において重要な役割を持つと考えられる。中枢神経に局在する1次繊毛の膜には限られた蛋白質のみが輸送される。その分子の1つが、G蛋白質共役型受容体（GPCR）に属すメラニン凝集ホルモン受容体1（MCHR1）である。MCHR1は摂食、情動、睡眠に関与することが知られているが、1次繊毛という非シナプス性の作用部位に着目した研究は進んでいなかった。そこで我々は、1次繊毛保有モデル細胞であるヒト網膜色素上皮細胞（hRPE1）の1次繊毛にMCHR1を強制発現させ、MCH-MCHR1を介した繊毛動態を解析した。まず、hRPE1細胞を無血清処理することで1次繊毛を伸長させた。その細胞に対し、1時間以上という長時間MCHで刺激すると、MCHR1陽性の1次繊毛が短くなる「縮退」現象が起こることを見出した（EC50=0.49 nM）。これは、GPCRの内在性リガンドそのものが繊毛長の短縮を引き起こす初めての報告である。そこで次に、種々の機能アッセイ、シグナルバイアス型MCHR1変異体および25種類の選択的阻害剤を組み合わせることにより、1次繊毛の縮退に関与するシグナルについて検討を行った。その結果、Gi/o依存的なAktリン酸化（T308、S473）が縮退初期における鍵分子であることを明らかにした。さらに、モータータンパク質Kif3AのsiRNA実験から、MCHR1を介したAktリン酸化は、1次繊毛において選択的に機能するシステムである可能性を示した。本研究は1次繊毛という「場」における、GPCRの機能および摂食・情動のメカニズム解明に新たな視点を与えるものである。