一般、大学院生、若手研究者（ポスター）

一般、大学院生、若手研究者（ポスター）グリア、ミエリン

P-071（1） Effects of acetate on LPS-induced nitric oxide production in primary rat microglia and BV-2 cell line 森山光章，河邊憲司，橋本綾乃，西村恭徳，的場教起，高野桂，中村洋一大阪府立大学生命環境科学研究科・統合生理学 The biomolecule acetate can be utilized for energy production, lipid synthesis, and several metabolic processes. Acetate supplementation has been reported to reduce neuroglial activation in the model of neuroinflammation induced by intraventricular injection of lipopolysaccharide（LPS）. However, the precise mechanism（s）underlying the anti-inflammatory effect of acetate is unknown. Recently, we have shown that acetate attenuates the nitric oxide（NO）production in cultured astrocytes, which is experimentally stimulated by LPS. To explore the effect of acetate on glial cells in more detail, we examined LPS-induced NO production in primary rat microglia and BV-2 cell line. In primary microglia, increasing acetate concentration attenuated the LPS-induced NO production in a dose-dependent manner, significantly more than 10 mM, although cell viability was not affected. In contrast, acetate had no effect on the LPS-induced NO production in BV-2 cell line. The LPS-induced expression of inducible NO synthase protein was significantly decreased by acetate in primary microglia but not in BV-2 cell line. The LPS-induced intracellular reactive oxygen species（ROS）productions were suppressed by the addition of acetate in primary microglia but not in BV-2 cell line. These findings suggest that acetate may alleviate glial cell damage during neuroinflammation by attenuating NO production in primary microglia. The difference between primary microglia and BV-2 cell line will be discussed.		P-072（1） Analysis of stop codon readthrough activity of negamycin analogs to produce myelin P0 isoform（L-MPZ）大谷嘉典¹，山口宜秀¹，田口晃弘²，濱田圭佑²，林良雄²，馬場広子¹ ¹東京薬科大学　機能形態学教室，²東京薬科大学　薬品化学教室 Large myelin protein zero（L-MPZ）is an isoform of myelin protein zero（P0）, containing additional 63 amino acids at C-terminus by stop codon readthrough mechanism in various species from frog to human（Yamaguchi et al., 2012）. L-MPZ is localized in the PNS compact myelin as like P0 although a role of this protein is still uncertain. Our recent study showed its adhesion property that is less than P0, suggesting that the ratio of P0 and L-MPZ in compact myelin may be important. Recently, stop codon readthrough agents have been developed to suppress nonsense mutations in the genetic disorders, such as Duchenne muscular dystrophy. However, before clinical use, influence of readthrough agents on naturally produced proteins by this mechanism should be clarified, since other readthrough proteins have also been reported. In present study, we examined the activities of novel readthrough agents, negamycin and its analogues（Taguchi et al., 2014）, on P0 gene to find the appropriate agent for in vivo experiments. Gentamicin and G418 were used as positive control agents. The expression vector containing human P0 cDNA was prepared. In vitro transcription/translation was performed under the presence of each agent, and volumes of L-MPZ and P0 were determined by Western blotting using anti-myc antibody to detect myc-tag added at their N-terminus. Relative ratio（%）of readthrough product（L-MPZ in total of L-MPZ and P0）was calculated as readthrough activity. This activity was nearly 10% without agent, indicating that P0 mRNA itself has relatively high readthrough activity. Presence of 1 μM G418 increased readthrough activity to 51.2%, however, higher concentration of G418（20 μM or more）severely inhibited protein synthesis. In contrast, protein synthesis was not affected by 200 μM of negamycin or its analogues, and one of the analogues showed higher readthrough activity（approximately 30%）compared to negamycin. The activities were also examined using the cells with stable expression of human P0 mRNA. In vivo study using the selected agents will be useful to identify physiological importance of translational readthrough in the PNS myelin and to develop safe readthrough agents for clinical treatment.

P-073（1） Study for interaction between drebrin and connexin 43 in glial assembly：グリアアセンブリにおけるdrebrin-connexin 43相互作用に関する研究石塚佑太，山崎博幸，白尾智明群馬大院・医・神経薬理学 Drebrin is an actin-binding protein, which has two major isoforms in mammals：drebrin E（Embryonic isoform）and drebrin A（Adult isoform）. Isoform conversion from drebrin E to drebrin A occurs during neuronal development. Although drebrin A is specifically expressed in neuron, drebrin E is not only expressed in neurons, but also in astrocytes. The previous study has shown that drebrin interacts with connexin 43（Cx43）, which is a member of the large family of the gap junction proteins, in submembrane regions of cell-cell contacts. It is considered that drebrin regulates the function of gap junction by serving as linker between Cx43 and other cytoskeletal molecules in astrocytes. However, it remains unclear whether drebrin directly binds to Cx43, and how drebrin regulates the formation and function of gap junction. In this study, we first confirmed the interaction between drebrin and Cx43 by co-immunoprecipitation（Co-IP）assay using HEK293 cells expressing myc-tagged drebrin E and HA-tagged Cx43. Cells were transfected with each plasmid DNA using Lipofectamine 3000 transfection reagent, and incubated for 48 hrs. The transfected-cells were subjected to Co-IP assay using anti-Cx43 antibody. We found that drebrin was co-immunoprecipitated with Cx43. This result indicates that drebrin interacts with Cx43. To clarify the interaction of drebrin with connexin 43 in glial assembly additionally, we analyze：（1）binding site of drebrin to Cx43；（2）whether drebrin directly binds to Cx43；（3）whether drebrin phosphorylation is involved in the interaction with Cx43；（4）whether drebrin affects the function of gap junction using drebrin knockout mice-derived astrocytes.		P-074（1）汎用性のある新たなヒト活性化アストロサイトモデルの構築と活性化制御薬剤の探索森尾花恵¹，鈴木翔太¹，伊藤涼¹，北村啓太¹，安西尚彦²，千葉寛¹，秋田英万¹，降幡知巳^1,2 ¹千葉大学大学院薬学研究院薬物学研究室，²千葉大学大学院医学研究院薬理学研究室【背景・目的】アストロサイトの活性化は様々な中枢神経系疾患で認められ、神経保護ばかりでなく病態進行にも関与すると考えられている。そのため、活性化アストロサイトは中枢神経系疾患治療・創薬の重要な標的であるが、その活性化の分子基盤の解明や薬剤スクリーニングを効率的に可能とするヒト活性化アストロサイトモデルは確立していない。一方、最近我々は長期継代培養および分化形質の制御が可能なヒト不死化アストロサイト（Human astrocyte/conditionally immortalized clone 35，HASTR/ci35）を樹立した。そこで、本研究ではHASTR/ci35による活性化アストロサイトモデルを確立すること、さらに活性化制御に関わる分子基盤解明や薬剤探索におけるその有用性を明らかとすることを目的とした。【方法】HASTR/ci35の活性化は、スクラッチアッセイおよび炎症性サイトカイン（IL-1βおよびTNF-α）曝露法によりおこなった。遺伝子発現プロファイルは、定量的PCR法および免疫染色法により解析した。【結果・考察】分化誘導したHASTR/ci35を用いてスクラッチアッセイをおこなったところ、形態変化を伴うスクラッチエリアへの細胞遊走が認められた。また、HASTR/ci35にIL-1βまたはTNF-αを曝露したところ、代表的な活性化アストロサイトマーカーであるGFAPのmRNAおよびタンパク質の発現上昇が認められた。さらに、IL-1β曝露HASTR/ci35では、LCN2、CCL5およびCXCL8のmRNA発現量が、非曝露細胞と比較してそれぞれ12.8±1.6倍、84.8±4.2倍、74.1±10.7倍に上昇した。一方、TNF-α曝露HASTR/ci35について同様に解析した結果、LCN2、CCL5およびCXCL8のmRNA発現量は、それぞれ非曝露細胞の4.2±0.5倍、41.8±1.5倍、22.9±1.9倍に上昇した。以上より、HASTR/ci35を用いることにより、汎用性に優れたヒトアストロサイト活性化モデルを構築することが可能であることが明らかとなった。現在、本モデルを用いてアストロサイト活性化制御に関わるサイトカインクロストークの解析や活性化制御薬剤探索を進めている。

P-075（1）新規ヒト不死化アストロサイトの分化誘導による新たなアストロサイト分化形質の探索鈴木翔太¹，伊藤涼¹，橋本真里¹，梅原健太¹，北村啓太¹，更屋敦則³，大島基彦³，安西尚彦²，千葉寛¹，秋田英万¹，降幡知巳^1,2 ¹千葉大院・薬・薬物学研究室，²千葉大院・医・薬理学研究室，³千葉大院・医・細胞分子医学研究室［背景・目的］アストロサイトは中枢神経系の機能制御に必須の役割を担っており、神経変性疾患の創薬や再生治療における重要な標的細胞である。これら創薬・治療研究の推進には、アストロサイトの分化や分化形質の分子基盤解明を可能とするモデル細胞が必要であり、これに対し我々は高い増殖能および基本的なヒトアストロサイト機能を保持する新規ヒト不死化アストロサイトhuman astrocytes/conditionary immortalized clone 35（HASTR/ci35）を樹立した。そこで本研究では、培養条件の最適化によりHASTR/ci35のアストロサイト分化形質を向上させるとともに、アストロサイト分化形質に関わる新たな細胞機能を同定することを目的とした。［方法］添加剤の異なる増殖用培地と分化誘導培地を用いてHASTR/ci35を培養した。mRNA発現の定量解析はリアルタイムPCR法により、網羅的なmRNA発現解析はRNAシークエンスとGene Set Enrichment Analysisによりおこなった。グルタミン酸トランスポーターEAAT2の活性はグルタミン酸輸送活性測定により解析した。［結果・考察］HASTR/ci35の細胞形態を観察した結果、分化誘導培地において、増殖用培地よりも顕著な細胞突起伸長を伴う形態変化が認められた。続いて、アストロサイトマーカー遺伝子であるALDH1L1のmRNA発現量を解析したところ、その発現量は分化誘導培地での培養時において増殖用培地培養時の18.2±1.5倍に増加した。同様に、増殖用培地培養と比べ、分化誘導培地による培養時において、EAAT2のmRNA発現量および活性は3.1±0.7倍および3.0±1.2倍上昇した。増殖状態および分化誘導時のHASTR/ci35の網羅的遺伝子発現プロファイルを解析したところ、細胞機能に関わる複数の遺伝子セットが有意に変動することが明らかとなった。［結論］以上より、分化誘導培地により、HASTR/ci35の分化形質は種々の細胞機能変動を伴い飛躍的に向上することが明らかとなった。現在、分化形質向上に伴って変動する細胞機能について更なる解析を進めているところである。		P-076（1）脳梗塞巣周辺部での活性化マイクログリアと神経細胞の貪食Activated microglia eliminate degenerating neurons by phagocytosis in the peri-ischemic region in the rat brain subjected to middle cerebral artery occlusion. 阿部尚子¹，松本調²，久門良明²，宮西和也¹，矢野元¹，田中潤也¹ ¹愛媛大院・医・分子細胞生理，²愛媛大院・医・地域医療再生学マイクログリアは変性した神経細胞死を貪食除去すると言われてきた。しかしながら、脳損傷や脳梗塞などの粗大な脳組織傷害核心部において、マイクログリアは神経細胞より早期に細胞死を来すため、変性神経細胞の貪食除去は不可能であって、この役割を果たすのは、骨髄から動員されてきたマクロファージである。しかしながら、一過性中大脳動脈閉塞tMCAOモデルの虚血巣核心部（コア）から周辺（ペナンブラ）までも含め、詳細な観察を行うと、コアを取り巻く約100μmほどの領域（デマルケーションゾーン）においては、活性化マイクログリアが変性神経細胞を貪食する像を観察できる。この活性化マイクログリアは、顕著な突起があることから骨髄由来マクロファージと区別でき、CD68陽性のファゴソームも骨髄由来細胞に比べ小さい。また、オリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーのNG2コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを発現している。eat-me signal認識によりファゴサイトーシスを促進するMFG-E8やMerTKを脳梗塞巣において活性化マイクログリアが発現し、神経細胞を貪食することで、神経細胞死を促進するという報告が最近なされた。我々は、tMCAO3日目以後のeat-me signal認識分子の発現変動を定量的リアルタイムRT-PCRと免疫組織化学染色により調べた。アポトーシス細胞に高発現するカスパーゼ3は、ペナンブラでも、tMCAO 3日後には発現上昇していた。一方、MFG-E8の発現には大きな変化はみられなかった。アポトーシス細胞認識分子のTREM2、フォスファチジルセリンに結合するGAS6、Protein S、さらに補体のいずれも発現上昇は5日目以降であった。特にProtein Sは、ペナンブラの活性化マイクログリア内に免疫反応性を認め、Protein S依存的に変性神経細胞を貪食していると考えられた。以上の結果は、マイクログリアは神経細胞死を促進するのではなく、死が決定した神経細胞のeat-me signalを認識し、貪食除去を行っていることを示唆している。